GENÉTICA MOLECULAR - AULA 3 - TRANSCRIÇÃO

TRANSCRIÇÃO

A transcrição consiste na síntese de uma molécula de RNA a partir de um molde de DNA. Na molécula de DNA, bifilamentar, um dos filamentos contém a informação, sendo chamado fita codificadora. O outro filamento, que é utilizado como modelo para a síntese, é denominado fita molde.

A síntese de RNA é realizada por uma enzima, a RNA polimerase. Para que ocorra a transcrição é necessario que a RNA polimerase reconheça uma região específica do gene, que delimita o ponto de início da informação. Esta região é chamada de promotor. Nos procariotos, o promotor apresenta duas sequências importantes para o reconhecimento, localizadas a -10 e -35 nucleotídeos do ponto de início da transcrição (denominado por convenção como +1). Nos eucariontes a estrutura do promotor é mais complexa, com um número maior de sequências de reconhecimento (que incluem sequencias a -25; -75; -90 e -100 nucleotídeos em um promotor basal).

A RNA polimerase

Em procariotos, há apenas um tipo de RNA polimerase, que pode se apresentar em duas formas: apoenzima e holoenzima. A diferença entre estas formas da RNA pol é a presença do fator sigma, uma das subunidades peptídicas que compõe a RNA pol. A apoenzima não possui fator sigma, ao passo que a holoenzima possui.

A presença do fator sigma habilita a enzima a reconhecer a região promotora dos genes a serem transcritos e a se ligar ao DNA. Entretanto, este mesmo fator sigma dificulta o exercício da atividade polimerásica pela enzima. Desta forma, após reconhecer o promotor e se ligar ao DNA, a holoenzima perde o fator sigma, convertendo-se em apoenzima. A apoenzima, por sua vez, possui elevada processividade na síntese, ao passo que não tem habilidade para reconhecer o promotor dos genes. Desta maneira, a holoenzima reconhece os genes a serem transcritos e se liga ao DNA e a apoenzima faz a síntese do RNA. 

Em eucariontes observamos 3 tipos de RNA polimerase: a RNA pol I, responsável pela síntese de rRNA (RNA ribossomal); a RNA pol II, responsável pela transcrição do mRNA (RNA mensageiro) e a RNA pol III, responsável pela sintese de tRNA (RNA transportador) e outros de pequena extensão. estas polimerases não reconhecem diretamente o promotor, necessitando do auxílio de proteínas que possuem domínios de ligação ao DNA e são chamadas fatores transcricionais. Ao se ligarem ao promotor, os fatores de trancrição promovem a formação da geometria de ligação requerida pela RNA polimerase para se associar ao DNA.

Após reconhecer a região promotora, a RNA polimerase encadeia os nucleotídeos de forma semelhante à DNA polimerase, ou seja, apresenta atividade polimerásica 5´- 3´. Lembro aqui que o RNA não possui timina, sendo a uracila encadeada em sua substituição. Esta etapa é conhecida como alongamento de cadeia.

No fim da trancrição, etapa denominada terminação, observamos diferenças entre procariontes e eucariontes. nas bactérias há duas estratégias de terminação, requerendo ou não a participação de uma proteína chamada rho. Na terminação independente de rho, também denominada terminação intrinseca, há uma sequência rica em pares A/U logo após a região que delimita o fim da transcrição, permitindo que a RNA pol se libere do DNA naturalmente. Já na terminação dependente de rho, a presença de uma região rica em pares C/G impede que a polimerase se libere naturalmente, havendo necessidade da ação da proteína rho, que libera a enzima.
Nos eucariontes, o termino da transcrição ocorre de forma indeterminada, havendo liberação da RNA polimerase em uma região variável após a sequência de poliadenilação.

Apesar de também poder haver correção de erros na transcrição, as RNA polimerases não apresentam a mesma eficiência no processo que as da DNAs polimerases (que possuem atividade exonucleásica). A correção no processo de transcrição pode ser feita atraves de i) correção cinética (ou pirofosfólise) e ii) correção nucleolítica e a taxa de erro fica em torno de 10-4 a 10-5.

pirofosfólise

correção nucleolítica

Tipos de RNA

Os principais tipos de RNA observados nas células procariontes e eucariontes são:

1) RNA mensageiro (mRNA) - responsável pelo carreamento da informação contida na molécula de RNA

2) RNA ribossonal (rRNA) - componente estrutural dos ribossomos

3) RNA transportador (tRNA) - responsável pelo carreamento de aminoácidos através do citoplasma para o sítio de tradução

Estes RNAs atuam cooperativamente para que ocorra a síntese de proteínas

Nas células eucarióticas, temos ainda:

4) RNA heterogêneo nuclear (hnRNA) –transcritos primários que possuem regiões contendo informações para codificação (EXONS) e regiões que não possuem tais informações (INTRONS) que irão gerar, após o processamento, o mRNA.

5) RNA pequeno nuclear (snRNA – small nuclear RNA) – RNAs de pequeno tamanho (cerca de 70 nucleotídeos), ricos em uracila (recebem genericamente a designação de Un), que participam da remoção dos introns do hnRNA. Ocorrem na forma de ribonucleoproteínas (SNRPs ou SNURPs).

6) RNA pequeno citoplasmático (scRNA – small cytoplasmic RNA) – pequenas moléculas de RNA, geralmente com cerca de 130 nucleotídeos, que ocorrem no citoplasma e em associação ao retículo endoplasmático e potencialmente associadas com proteínas envolvidas em transporte de mRNA (?) e seleção de proteínas. Ocorrem na forma riboproteínas (SCYRPs).

Achou que havia acabado? Se enganou:

7) MicroRNA (miRNA) – RNAs de cadeia curta (com 20 a 30 nucleotídeos) que se associam a um complexo proteico (RISC – RNA induced silencing complex) para reprimir a expressão de genes alvo, através da formação de duplexes na região 3´não traduzida do mensageiro.

AULAS 2 E 3 - GENÉTICA ODONTOLOGIA - CROMOSSOMOS

CROMOSSOMOS

Os cromossomos são as unidades básicas da hereditariedade. O estudo destas estruturas celulares responsáveis pela transmissão das características é denominado citogenética.  Estruturalmente, o cromossomo pode ser definido como uma unidade filamentosa de DNA altamente enovelada, que é observada durante o processo de divisão celular. Entretanto, o uso generalizado levou à associação do termo cromossomo ao material genético de uma célula.

O enovelamento característico dos cromossomos é decorrente da associação do filamento de DNA com proteínas, constituindo uma unidade estrutural denominada cromatina. A cromatina pode ser classificada em dois grupos gerais: i) a cromatina mais condensada, indisponível para transcrição dos genes, que é chamada heterocromatina e ii) a cromatina mais frouxamente enovelada, disponível para transcrição dos genes, denominada eucromatina. O empacotamento da cromatina é extremamente importante para a viabilidade da célula. Imagine que você fosse capaz de alinhar os 46 cromossomos que compõe o genoma nuclear humano. O filamento formado teria cerca de 1,8m! Isso mesmo, cerca de um metro e oitenta!

 

As proteínas que se associam ao DNA para compor a cromatina pertencem basicamente a dois grupos: i) as histonas, proteínas de caráter básico que são as responsáveis pelas etapas iniciais de condensação (enovelamento) do DNA e ii) as proteínas não-histonas, que pertencem a uma ampla variedade de famílias protéicas e são responsáveis pelas etapas posteriores de condensação e que culminam com o empacotamento máximo da cromatina, denominado cromossomo. O cromossomo é, então, o DNA na sua forma mais enovelada (e que se apresenta como uma molécula em forma de bastão com um comprimento cerca de 10.000 vezes menor que a molécula de DNA que o originou). 

Diversas etapas, inicialmente envolvendo os 5 tipos de histonas (H1, H2a, H2b, H3 e H4) devem ser cumpridas para que o enovelamento possa ser concretizado. A associação com unidades de quatro tipos de histonas em pares (2 unidades de cada um dos tipos H2a, H2b, H3 e H4), denominada octâmero de histonas, é o primeiro passo, formando o nucleossoma, uma estrutura que se assemelha a um colar de contas. A presença da histona H1 nos intervalos do nucleossoma forma o solenóide, que, por sua vez, é enovelado sobre si mesmo gerando uma fibra cromossômica. O empacotamento sequencial das fibras gera o cromossomo propriamente dito.

Podemos identificar uma série de elementos na organização estrutural de um cromossomo. Cada filamento constitui uma cromátide, que possui 2 extremidades denominadas telômeros. A cromátide é dividida por uma região mais condensada, denominada centrômero. O centrômero tem papel importante na separação dos cromossomos, pois é nesta região que se encontra o cinetocóro, complexo proteíco ao qual as proteínas do fuso de divisão se ligam.

O centrômero divide a cromátide em dois segmentos: o braço curto (referido como p) e o braço longo (referido como q). Dependendo da posição que o centrômero ocupa, podemos classificar os cromossomos em metacêntrico (centrômero na região central); sub-metacêntrico (centrômero deslocado para uma das extremidades, estabelecendo um braço que ocrresponde a cerca de 2/3 do cromossomo e outro correspondente a 1/3); acrocêntrico (centromero nitidamente deslocado para uma das extremidades) e telocêntrico (centrômero na região telomérica, fazendo com que o cromossomo apresente apenas 1 braço).

Em relação ao tamanho, originalmente os cromossomos foram divididos em 7 grupos (A a G), em ordem decrescente de tamanho:

- grupo A – cromossomos 1, 2 e 3

- grupo B – cromossomos 4 e 5

- grupo C – cromossomos 6 a 12 e X

- grupo D – cromossomos 13 a 15

- grupo E – cromossomos 16 a 18

- grupo F – cromossomos 19 e 20

- grupo G – cromossomos 21, 22 e Y

Com as técnicas de bandeamento, cada cromossomo pode ser identificado a partir de seu padrão de bandas. Estas técnicas consistem no tratamento de uma preparação de células rompidas que encontravam-se em processo de divisão, que são coradas e analisadas em microscópio. Com o bandeamento é possível identificar cada um dos cromossomos. A partir de então, os cromossomos autossômicos são numerados de 1 a 22 em ordem decrescente de tamanho. O par sexual é composto pelos cromossomos X e Y. Desta forma, a espécie humana apresenta 24 tipos de cromossomos diferentes: os 22 autosomos, e os sexuais X e Y (que apesar de comporem um par são diferentes entre si).

GENÉTICA MOLECULAR - CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

ATENÇÃO - BIOLOGIA

IMPORTANTE

RETIFICAÇÃO DE DATAS DE PROVA

PROVA 1 - 11/04

PROVA 2 - 13/06

SEGUNDA CHAMADA - 20/06

PROVA FINAL - 27/06

Assim, nosso cronograma definitivo é:

21.02 Apresentação do curso, avaliações. Histórico da Genética Molecular
28.02 Estrutura de ácidos nucleicos e propriedades físico-químicas
07.03 FERIADO
14.03 Replicação do DNA. Características e dinâmica do processo.
21.03 Transcrição. A síntese das moléculas de RNA.
28.03 Processamento. Maturação dos intermediários da informação.
04.04 ESTUDO ORIENTADO

11.04 PROVA 1

18.04 Síntese de proteínas. O Código genético e a montagem do complexo traducional.
25.04 Fundamentos da regulação da expressão gênica
02.05 Bases moleculares da herança
09.05 Mutações gênicas e polimorfismos genéticos.
16.05 Estudo de polimorfismos genéticos
23.05 Bases genéticas dos erros inatos do metabolismo
30.05 Epigenética
06.06 ESTUDO ORIENTADO
13.06 PROVA 2
20.06 VEA
27.06 PROVA FINAL

GENÉTICA MOLECULAR - CIÊNCIAS BIOLÓGICAS - AULA 2 - REPLICAÇÃO

REPLICAÇÃO DO DNA

O DNA apresenta características estruturais únicas que o tornam adequado para ser a molécula da hereditariedade, como o fato de ser bifilamentar e a interação específica entre as bases nitrogenadas, através das pontes de hidrogênio estabelecidas.
Ao apresentarem o modelo estrutural para a molécula de DNA, Watson & Crick propuseram que a replicação do DNA fosse realizada de uma forma tal que cada filamento, individualmente, fosse utilizado como modelo para síntese de seu filamento complementar. A demonstração experimental foi feita por Meselson e Stahl (1958), em experimentos utilizando incorporação de nitrogênio com densidade diferenciada. Este trabalho foi muito importante para consolidar a aceitação sobre a proposição molecular de Watson e Crick. No estudo, os pesquisadores cultivaram células bacterianas por várias gerações em meio de cultivo contendo apenas N15 disponível para síntese de biomoléculas. Ao transferirem as bactérias para meio contendo N14, a formação de moléculas híbridas de DNA, contendo um filamento com N14 e um filamento com N15 foi a base para a determinação do modelo SEMICONSERVATIVO de duplicação.

A enzima responsável pela síntese de DNA é a DNA polimerase. Em procariotos, encontramos 3 tipos de DNA polimerase: DNA pol I; DNA pol II e DNA pol III. Através de experimentação com mutantes bacterianos, sabe-se que DNA pol I tem papel representativo na correção de erros e que DNA pol III é a principal enzima para síntese de DNA (recentemente, duas novas polimerases, DNA pol IV e DNA pol V, ambas associadas com reparo de lesões no DNA foram inseridas neste rol). Em eucariotos há um grande número de polimerases. Para replicação, são necessárias as polimerases alfa, delta e epsilon. A polimerase beta está associada a correção de erros e a polimerase gama é responsável pela replicação do DNA mitocondrial. Caracteristicamente as DNA polimerases apresentam atividade polimerásica 5´-3´ e atividade exonucleásica 3´-5´. Esta última assegura a correção de possíveis erros de pareamento durante a síntese de DNA. O sistema funciona pela competição dos sítios catalíticos: Como a afinidade do sítio polimerásico é maior que a do sítio exonucleásico, apenas quando o nucleotídeo alocado não realiza o pareamento adequado é possível removê-lo. Há, ainda, a atividade exonucleásica 5´-3´ exibida pela DNA polimerase I, que permite a remoção dos iniciadores e auxilia no reparo a erros identificados após a replicação.

Para que ocorra a replicação é necessária a ação de uma série de enzimas e proteínas que prepararão a molécula de DNA para a ação da polimerase. A região na qual a replicação se inicia é denominada origem de replicação (ori). Em procariontes, esta região ocupa um segmento de cerca de 220pb, sendo constituída por sequências conservadas dispostas de maneira específica na molécula de DNA. Na ori observamos a ocorrência de 3 repetições de uma sequência conservada de 13 nucleotídeos (GATCTNTTNTTTT) seguida de quatro repetições de uma sequência de 9 nucleotídeos (TTATNCANA). Nesta região é formada a bolha de replicação através da ação do aparato enzimático da replicação

A girase promove a torção negativa necessária para que a molécula de DNA possa ser duplicada. Já a helicase tem o papel de romper as pontes de hidrogênio entre as bases nitrogenadas. As proteínas SSB estabilizam os filamentos de DNA separados e a primase realiza a síntese do iniciador ou primer. Assim forma-se um complexo replicativo que permite a ação da DNA polimerase e a forquilha de replicação avança para que a replicação tome curso. Como os filamentos do DNA são antiparalelos, enquanto uma das fitas é sintetizada de forma contínua, a outra fita é sintetizada em pedaços, denominados fragmentos de Okazaki. Assim, a replicação, além de semiconservativa, é SEMIDESCONTÍNUA. A ligase tem papel de unir os segmentos sintetizados para que a replicação possa ser concluída. é importante lembrar que, atraves da atividade exonucleásica 5´-3´, o iniciador é removido, sendo substituído por um segmento de DNA.

Nas células eucariontes, como o DNA é linear, uma das extremidades da fita descontínua terminal não é completamente duplicada pelo aparato de replicação do replissoma. Nesta região age uma enzima ribonucleoproteica especial, descoberta na década de 80, denominada telomerase. A descoberta foi agraciada com o prêmio Nobel em 2009!

Seus principais componentes são codificados pelos genes TLC1 (molde de RNA) e EST2 (porção catalítica). Esta enzima utiliza seu próprio constituinte de RNA para servir de molde à duplicação das sequências repetitivas TTAGGG/TTGGGG que compõe o telômero. 

A atividade telomerase é observada em todas as células em divisão, sendo diminuída progressivamente em células com maior diferenciação.

AULA 1 - GENÉTICA ODONTOLOGIA - DIVISÃO CELULAR

O CICLO DE VIDA DA CÉLULA

Durante sua vida, uma célula passa por diferentes etapas, caracterizadas por eventos celulares específicos e por alterações biológicas importantes. O fluxo entre estas etapas, ou transições, é finamente regulado e requer a ação de proteínas específicas, em geral proteínas quinases, que controlam a sucessão de etapas. Basicamente as etapas ocorrem de forma cíclica, representando o ciclo de vida da célula. Este ciclo é dividido em 2 fases: a intérfase e a divisão (mitose).

A intérfase pode ser subdividida em três etapas. As fases G1, S e G2. Na fase G1, também chamada fase de crescimento, a célula cresce, dobrando seu conteúdo citoplasmático. Neste momento há intensa síntese de RNA e proteínas, além das diversas moléculas necessárias ao metabolismo da célula. Literalmente nesta fase a célula dobra seu tamanho. Na fase S, ou fase de síntese, ocorre a duplicação de DNA, um evento que será estudado mais a fundo posteriormente e que consiste na duplicação do material genético. este evento requer um aparato enzimático específico e objetiva copiar as informações de forma fidedigna. Na fase G2, ou de preparação para a divisão, a célula produz as moléculas necessárias ao processo de divisão celular. Esta etapa é muito importante, pois como o DNA estará enovelado durante a divisão (fase M), não há possibilidade de síntese das moléculas necessárias ao processo. Assim, tudo o que é necessário à divisão tem que ser produzido nesta etapa.

Eventualmente algumas células altamente especializadas não cumprem a transição de comprometimento com a divisão celular, não ultrapassando o primeiro ponto de checagem durante a fase G1. Não ultrapassando este primeiro ponto, denominado ponto de restrição, a célula entra em repouso, em um fenômeno denominado quiescência. Esta etapa é também chamada de fase G0 ou fase quiescente. Lembre que o grau de diferenciação da célula é inversamente proporcional a seu potencial de divisão. Assim, células quiescentes, são, invariavelmente, MUITO especializadas.

Durante a etapa de divisão celular, dois fenômenos importantes ocorrem: a cariocinese, ou divisão do material genético e a citocinese, ou divisão do conteúdo citoplasmático. Para fins didáticos, o processo de mitose foi subdividido em etapas, a saber: 1 - Prófase; 2 - Metáfase; 3 - Anáfase e 4 - Telófase. Aguns autores, ainda, dividem a Metáfase em ProMetáfase e Metáfase propriamente dita. Entretanto, o mais importante é que possamos compreender os eventos que ocorrem no processo de divisão, lembrando sempre que se trata de um evento contínuo.

links interessantes com animações:
http://www.youtube.com/watch?v=YyYL2CW33WY

http://www.youtube.com/watch?v=SYb8mndHsuo&feature=related
http://www.youtube.com/watch?v=5gV5OML7jtA
http://www.youtube.com/watch?v=FFHmGGySM-0
http://www.youtube.com/watch?v=DC8wEHiXCBA&feature=related

GENÉTICA MOLECULAR - CIÊNCIAS BIOLÓGICAS - AULA 1 - ESTRUTURA DE ÁCIDOS NUCLEICOS

ESTRUTURA DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Os principais trabalhos que revelaram que o DNA era a molécula responsável pela hereditariedade foram conduzidos entre as décadas de 20 e 50 do século passado. Os experimentos de Griffiths e colaboradores (1928) e Avery e colaboradores (1944) mostraram o papel do DNA na determinação da capacidade de virulência em Pneumococos. Inicialmente, Griffiths e colaboradores observaram que, ao injetarem em cobaias uma mistura de culturas de células avirulentas com células virulentas mortas por calor, as cobaias desenvolviam pneumonia e células vivas virulentas eram recuperadas das carcaças. O fenômeno foi denominado princípio transformante. Em 1944, Avery et al., utlizando plaqueamento em meio rico, observaram que o princípio transformante ocorria independente da utilização de uma cobaia. Ao fracionarem o extrato de células mortas por calor, determinaram que a fração que detinha a capacidade de transformação era um precipitado alcoólico, que possuia DNA, RNA e proteínas. Ao tratarem o precipitado com enzimas específicas para degradar seus componentes (protease, RNase e DNase), descobriram que somente a fração tratada com DNase perdia a capacidade de transformar. O DNA era, então, o princípio transformante!

O fenômeno é explicado pela capacidade das bactérias capturarem fragmentos de DNA do meio ambiente. As células virulentas mortas tem seu DNA fragmentado. Algumas moléculas irão gerar fragmentos que contém as informações necessárias para produzir a cápsula, envoltório responsável pela capacidade de virulência. Assim, uma célula avirulenta, ao capturar e integrar um segmento de DNA que a capacita a produzir cápsula, torna-se virulenta!

Hershey e Chase (1952), por sua vez, revelaram o papel na hereditariedade em experimentos com bacteriófago, demonstrando que o material injetado pelo vírus na célula para assegurar sua multiplicação era o DNA. Este experimento clássico se valeu da possibilidade de marcar radioativamente de forma diferencial as proteínas (que constituem o capsídeo viral) e o DNA, utilizando enxofre radioativo (S35) e fósforo radioativo (P32), respectivamente.

Os ácidos nucleicos são as moléculas chave para a hereditariedade e expressão gênica. Basicamente temos dois tipos de ácido nucleico: O DNA, ácido desoxiribonucleico - responsável pela transmissão da informação genética, e o RNA, ácido ribonucleico - responsável pela expressão das informações. São moléculas polinucleotídicas, isto é, compostas por várias unidades monoméricas denominadas nucleotídeos. Cada nucleotídeo apresenta em sua estrutura três elementos: um açúcar de 5 carbonos (pentose), um grupamento fostato (ácido fosfórico) e uma base nitrogenada. O grupamento fosfato está ligado ao carbono 5 da pentose e a base nitrogenada ao carbono 1. No carbono 3 encontramos um grupamento hidroxila. O açúcar (a 2-desoxiribose no DNA e a ribose no RNA) e o fosfato compõe a porção constante, comum a todos os nucleotídeos. A base nitrogenada é a porção variável, diferindo em cada tipo de nucleotídeo. Os tipos mais comuns de base nitrogenada são a adenina (A), a citosina (C), a guanina (G), a timina (T) e a uracila (U). A, C, G e T estão presentes no DNA e A, C, G e U estão presentes no RNA.

A descoberta da estrutura do DNA envolveu a análise de evidências químicas e físicas. A evidência química veio através dos trabalhos de Chargaff e colaboradores. Ao avaliarem o DNA de diversos tipos de organismos, os pesquisadores determinaram que as concentrações de adenina e timina eram sempre semelhantes, assim como as concentrações de citosina e guanina, ou seja, existia uma proporção 1:1 entre as bases A e T e C e G. Já a evidência física é devida aos trabalhos de Franlink com difração de raios X, que revelaram a estrutura bifilamentar com torção helicoidal da molécula.

Assim, em 1953, Watson e Crick publicaram o trabalho que revelou a estrutura molecular do DNA e suas implicações moleculares. A molécula é composta por dois filamentos polinucleotídicos torcidos um sobre o outro de forma regular, que se mantem interligados através de pareamento específico por pontes de hidrogênio entre as bases nitrogenadas. Adenina pareia com Timina através de duas pontes e Citosina pareia com Guanina através de três pontes.

O link para o artigo original, publicado na edição de 25 de abril de 1953 na revista nature é:
http://www.nature.com/nature/dna50/watsoncrick.pdf